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ELISA酶联免疫吸附试验

时间:2019-11-27 23:17    浏览:
                                                                                                                           ELISA酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验

(一) 原理是酶免疫技术中应用最广的一种。在合适的载体上,酶标记

抗体或抗原与相应的抗原或抗体形成酶标记的抗原抗体免疫复合物,在一定的底物参与下

,复合物上的酶催化底物,使其水解、氧化或还原成另一种带色物质。由于在一定的条件下

,酶的降解底物和呈现色泽是成正比的,因此,可以应用酶标测定仪进行测定,从而计算出

参与反应的抗原和抗体的种类和含量。ELISA的技术类型很多,现仅将常用的几种简介如下

1 间接法主要用于检测血清中的抗体,也可检测抗原(图341)。

341间接法原理示意图

2 双抗体夹心法用于检测标本中大分子抗原(图342)的一种方法。

342双抗体夹心法原理示意图

 

3 抗原竞争法此法也称竞争性抑制法,主要用于测定小分子抗原(图343)。其大致

步骤

如下:①使已知的抗体吸附于载体表面;②将可能含抗原的待检溶液和酶标记的已知抗原溶

液以适当比例混合,加入已包被的载体孔中;③加入酶底物溶液,产生颜色反应。色深表示

结合的酶标记抗原多,而待检溶液中未标记的抗原量少;反之,色浅表示结合的酶标记抗

原少,而待检溶液中抗原量多。

343抗原竞争法原理示意图

 

此外还有直接法(检测抗原)、双夹心法(检测抗原或抗体)、非标记抗体酶法(检测抗原或抗

)等。

(二) 材料和方法(以检测猪流行性腹泻病毒抗体为例)

1 材料

(1) 聚苯乙烯塑料微量组织培养板:4×10孔,上海塑料三厂生产。

(2) 包被液(pH值96):NaHCO3 293g、Na2CO3 195g,蒸馏水加

1 000ml,置4℃保存。

(3) 洗涤液(001mol/L、pH值74PBS):NaCl 80g、KH2PO402g、N

a2HPO4·12 H2O 29g、KCl 02g、Tween20 05ml,加蒸馏水至1000ml。

(4) 保温液:牛血清白蛋白(BSA) 01g、005% PBSTween20 100ml,4

℃保存。

(5) 底物溶液(OPDH2O2)

磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH值50):02mol/L Na2HPO4(284g/L)257ml、01mol/

L柠檬酸(192g/L)243ml、蒸馏水50ml。

底物溶液:磷酸盐柠檬酸缓冲液100ml、邻苯二胺(OPD)40mg、30%H2O2 015ml,现

配现用。

(6) 终止液(2mol/L H2SO4):浓硫酸222ml、蒸馏水1778ml。

(7) 猪流行性腹泻(PED)抗原:PEDV猪胎肠原代细胞培养物,反复冻融,65℃

30min灭活。最后以3 000 r/min离心30min,取上清分装,-20℃保存备用。抗原的蛋

白浓度为300μg/ml。

(8) 酶标兔抗猪抗体结合物:按郭春祥方法制备。mol/L比为196,酶结合

物效价为1∶10 000。

(9) 被检猪血清:采自疫区猪和病猪。PEDV免疫猪血清及健猪血清分别用于

阳性、阴性对照。

(10) 酶联免疫吸附试验检测仪:南京华东电子管厂生产。

 

2 ELISA操作程序(间接法)

(1) 抗原包被:用包被液将PEDV抗原作1∶5稀释包被反应板,每孔100μl,

同时设阴性细胞培养物对照孔,置4℃过夜。

(2) 洗涤:用洗涤液洗涤2次,每次2min,沥干。

(3) 加入被检血清:用保温液将被检血清作1∶100稀释,加入反应板相邻的

两个孔中,每孔100μl。同时作阴、阳性标准血清对照,置37℃孵育1h。

(4) 洗涤3次:方法同上。

(5) 加入酶结合物:用保温液将酶结合物作1∶4 000稀释,加入反应孔

中,每孔100μl,置37℃孵育1h。

(6) 洗涤3次:方法同上。

(7) 加入底物:每孔100μl,置室温暗盒内显色20min。

(8) 加入终止液:每孔50μl,静置5min。

(9) 测定OD值:用检测仪,于492nm波长,按仪器使用及制定标准要求调节仪

器,测定各反应孔的OD值,记录结果。

(三)结果判定凡检测血清P/N值超过14的,均判为阳性。肉眼观察,凡

反应孔的颜色比正常细胞对照孔、正常血清对照孔颜色深者为阳性。

(四) 注意事项

1 在各载体中使用最多的为聚苯乙烯塑料板。不同厂牌,甚至不同批号的反应板吸附性能

往往有很大差异,因此使用前需要加以选择。方法为:在整块板上测定同一标本,求出每一

对孔的平均OD值,将此值与该板的总均值相比,其差值需在±10%以内。

2 为了增加聚苯乙烯板对某些抗原或抗体的吸附作用,可试用鞣酸处理,牛血清白蛋白处

理,改变载体的表面电荷,引入化学基团等方法处理反应板。

3 如非特异性吸附较强,需考虑采用封闭等方法排除。

(1) 封闭:可选用4%~10%牛血清白蛋白、10%小牛血清、10%马血清、01%

25%明胶等。

(2) 去污剂:可阻止非特异吸附,而不影响特异性抗原抗体反应。常用的有0

05%~05%吐温20、吐温80、01%NP40等。

(3) 高盐浓度缓冲液:如含05mol/L NaCl及005%吐温的磷酸盐缓冲液(pH

80)。

(4) 缩短孵育时间:保温液中加入终浓度4%的聚乙二醇(PEG,MW6 000)

可缩短抗原抗体反应的孵育时间(20min以内)。

4 由于反应板可能存在边缘效应,因此测定标本时至少要取两孔的平均值。

各种常用的酶标反应比色计性能不一,测定时需根据各自的仪器确定阈值。

 
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