多聚酶链反应_南京卡米洛生物工程有限公司
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多聚酶链反应

时间:2019-10-12 11:33    浏览:

多聚酶链反应

随着DNA分子的发展,1985年美国Cetus公司人类遗传部Mullis等建立了一种称为多聚酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)的DNA扩增新技术。该技术是对特异性DNA片段进行非细胞依赖性的体外扩增。它的问世,标志着生物学领域经历了一次崭新的技术革命,因此被“Science”杂志誉为1989年最有影响的技术发明,也有人将PCR技术列为20世纪90年代十大生物学热点之冠。这种方法近几年来在分子生物学和临床医学及兽医学领域中已得了迅速的发展,在微生物学诊断和科研方面已被应用,并具有巨大的潜在应用价值。

(一) PCR的基本原理 PCR扩增放大DNA的基本原理和基本过程如下:将含有所需放大分析序列的DNA加热变性为单链,然后加入一对与所放大分析的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物,即左端引物和右端引物。这对引物必须将所需放大分析的DNA片段包括在其范围内。引物可根据已知DNA序列用DNA自动合成仪合成,一般只需20个碱基对,但不能更少,否则在68℃就不能保持与DNA单链的互补结合,在有DNA多聚酶和4种三磷酸脱氧核苷(dATP、dTTP、dCTP、dGTP或dNTP)存在下,以放大分析的DNA单链为模板,按5′到3′方向将引物延长,自动合成新的DNA链,使DNA重新变成双链。因此,在反应中左、右引物不仅起指导作用,而且起到特异性限制放大合成DNA片段范围大小的作用。将合成的DNA双链再次加热变性,继续重复以上的DNA多聚酶反应,左、右引物之间这段DNA的量就可成指数倍数增加。如重复进行这一反应n次,则从理论上讲,PCR放大的DNA倍数就为2n倍,这样DNA的量就可在数小时内特异地获得几十万倍的放大。T4DNA多聚酶和大肠杆菌DNA多聚酶I的klenow片段都可用于PCR,但比较试验的结果显示T4放大产生的DNA与模板一致,而用klenow片段放大的产物内除含有与模板一致的DNA外,还混有非特异的低分子片段,因而T4比klenow更适用于PCR。1988年Erlich等从耐高温的水生嗜热菌(Thermus aquaticus)中提取了一种简称为Taq的耐高温DNA多聚酶。由于Taq多聚酶几乎不受加热变性的影响,因而用这种酶进行PCR省去了每次加热变性后重新加入DNA多聚酶的步骤,使重复反应能连续进行。

(二) PCR的特点

1.敏感 由于PCR能将一段DNA分子特异地放大约100万倍,因而极为敏感。PCR可用于检测DNA含量极微的标本(1ng DNA),甚至可将单根头发丝中所含的单一分子DNA放大后进行检测。

    2。 特异 PCR不仅敏感,而且特异。据报道,将PCR放大后的DNA克隆作序列分析,结果表明,PCR放大的DNA序列与原模板DNA序列一致。

3. 简易快速 PCR可用于直接检测粗制的DNA标本,如细胞裂解液、血细胞DNA提取液,省去了对标本中检测DNA的精制纯化过程。PCR在一天内即能完成,如尚需作电泳分析、杂交或序列分析等,一般也可在1~3天内完成。

4. 可检测固定包埋的病理标本或部分DNA降解标本 因为PCR并不要求所放大的DNA为完整的大分子,所以PCR的另一特点是可用于检测已用福马林固定或石蜡包埋过的病理组织标本或只有5μm薄的切片,也能用于检测已部分降解的DNA标本。

5。 直接作序列分析 PCR可提供足够量的特异DNA作序列分析,省去了以往必须克隆后再作序列分析的过程。在PCR引物上事先用32P作末端标记,放大后的DNA可直接作Maxam-Gilbert序列分析,或用双脱氧核苷酸终端法作序列分析。

6.可放大RNA   PCR也能对RNA或cDNA进行放大,有些外显子散在分布在一段很长的DNA中,因而难以将整段DNA大分子放大和作序列分析,但如用mRNA作为模板,就可将外显子集中,一次就能用PCR完成对外显子的放大和序列分析。

7.无放射性 PCR放大作用本身具有特异性,因而放大后只要用电泳测定到相应量和大小的DNA片段,就能证明标本中存在所检测的DNA序列。由于PCR放大的DNA量足以使肉眼就能对电泳后经溴化乙锭染色的DNA条带进行观察或摄影,因而PCR可作为一种不用同位素的非放射检测方法,易于在临床检测中推广。

需要指出的是,上述的PCR对DNA病毒的诊断显示了很高的敏感性,操作亦很简单,易于应用。但对RNA病毒的诊断,就比较复杂,在进行PCR之前,首先应进行RNA的分离,随后作反转录,即在反转录体系中加入一条与mRNA多聚A互补的多聚T作引物,反转录与mRNA互补的cDNA链,作为后续实验的检测物,此即为检测RNA病毒用的RT-PCR。

在PCR的基础上,Sano于1992年又创建了免疫PCR,其原理与PCR是一致的,只是在某些环节上有差别。免疫PCR就是将抗原抗体反应与PCR结合在一起,构成的一种新技术。首先将待测的抗原吸附于固相载体上,经封闭和冲洗后,加入特异的抗体,此抗体常采用生物素标记,经孵育和冲洗后,加入作为连接分子的亲和素,随后,孵育和冲洗,再加用生物素标记的DNA,孵育和冲洗 ,去除游离的DNA分子,然后加入PCR扩增系统(用其代替ELISA的酶催化底物显色),使结合于固相载体上的DNA放大,再用琼脂糖凝胶电泳检测放大的PCR产物,经溴化乙啶染色和照像,记录PCR产物的电泳结果,通过底片上PCR产物的光密度,可以得出PCR的量,即代表固相上吸附的待检抗原量。将其与用标准抗原制备的标准曲线进行比较,就可以准确地得出待测抗原的实际量。免疫PCR中的DNA,只是一个做为指示分子的角色,用DNA聚合酶将结合于固相上的DNA特异放大,由此定量检测抗原。所以,免疫PCR的敏感性比ELISA高105倍,且ELISA产生的背景信号很弱,只能测到几百个分子的抗原,而免疫PCR在理论上可以检测到一个分子的抗原,因此,免疫PCR特别适用于检测一些含量特别少的抗原分子。需要指出的是,免疫PCR技术目前仍处于研究阶段,在技术上还须要继续完善与提高,配套试剂还须要研制,方能推广应用。除上述外,于近些年来又建立了一些新的PCR技术如:带尾式PCR、抛锚式PCR、套叠式PCR、竞争模板式PCR、复合式PCR、不对称式PCR、重组式PCR等。
                                                                                                                                                                                                                                                       南京卡米洛生物工程有限公司

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